洁净区环境监测作为污染控制策略（CCS）的重要组成部分。评估和定义粒子、微生物监测所需的合适取样点、取样类型、取样量和取样频率，这些要素用于执行洁净环境系统性能确认（EMPQ）。

一、法规依据

✦GB/T16294-2010 医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法

✦GB/T16293-2010 医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法

✦GB/T16292-2010 医药工业洁净室（区）悬浮粒子的测试方法

✦GB50591-2010 洁净室施工及验收规范

✦GB50457-2019 医药工业洁净厂房设计规范

✦GB50243-2002通风与空调施工质量验收规范

✦GB50073-2013 洁净厂房设计规范

✦ISO 14644-1 空气洁净度的颗粒浓度分类

✦ISO 14644-3洁净室和相关控制环境

✦ISO 14644-4洁净室和相关控制环境

✦ISO 14644-5洁净室和相关控制环境

✦PDA TR13 环境监测

✦PIC/SPE 009-14 GMP – 附录1 无菌药品

✦欧盟药品法规GMP – 附录1 无菌药品

✦《药品生产质量管理规范（2010年修订》及附录

✦现行版中国药典

✦现行版美国药典

二、基于风险的环境监测程序要考虑的一般要点

1、静态环境监测点位

可按照ISO 14644-1的数量规则进行均匀布点，亦可根据风险评估及气流流型数据增减点位。动态环境监测点位则需要通过风险评估输出，风险评估又基于工艺流、人物流的关键复杂性、暴露情况、所涉及的操作与距离、常规监测数据（若有）、确认期间获得的数据以及环境中分离的典型微生物菌群知识。

在执行评估之前需定义几个要素：范围、风险因素、风险管理工具及风险因素评级标准。评估流程一般为定义关键、非关键区，识别范围内风险因素，评估风险因素等级，根据风险等级策略布点定频率，执行监测进行风险控制，得到数据获得风险降低及接受。

微生物和微粒污染最有可能对产品质量产生不利影响并因此具有最高风险区域或位置，应包括：

l靠近暴露产品或接触产品表面和关键的区域（如，填充针、塞碗）

l与干预相关的活动

l最难以进入或难以清洁和消毒的区域

l洁净室操作员活动频繁和/或复杂的位置（如，触摸面板、摄子、门把手）

l人员多、人员量大的区域（如，更衣室入口）

l高物流区域

l在生产过程中，什么地点最容易长菌

l哪些地方是清洁、消毒或灭菌时最难覆盖接触或最难奏效的部位

通过冻干灌装线举例来说明：

根据灌装操作过程，每条灌装线至少应设置3个监控点：进口转盘处、灌装点、封盖区半胶塞，转盘处，放置空瓶，经常有人员的活动，容易发生污染事件，灌装区是生产的关键点，粒子污染事件将直接影响到产品的质量，封盖区半胶塞也是生产的关键点；冻干机前设置监测点，冷冻干燥机前，瓶口没有完全密封住，需要保证冷冻干燥机的送料区附近的空气质量；灌装线背景区设置监测点，该采样点可以作为B级背景区的参考点，同时当有污染物进入的时候，能够及时发现，有一个预警的作用。

2、洁净室内均匀的几何图形或网格轮廓，以覆盖整个区域

3、由于某些限制或替代/最坏情况的范围而不会成为取样点的评估和理由

4、确认期间获得的历史数据和/或数据

5、厌氧生物

l在普通的好氧洁净室环境中不太可能得到严格的厌氧菌株。可以通过风险评估对厌氧生物的进行定期和/或调查监测。它主要用于检测厌氧菌，例如在标准需氧条件下无法检测到痤疮角质杆菌。

l厌氧菌检测的频率可以与常规的监测程序不同。

l尽管厌氧菌是皮肤微生物菌群的重要组成部分，但是有氧环境监测被认为足以检测到洁净室人员穿衣不当和无菌技术不佳。仍应考虑对涉及严格厌氧菌的无菌测试失败进行厌氧环境监测。

6、气流可视化研究，即烟雾研究，特别关注气流的死角部位，可作为区域最差点。

三、取样量

1、对于粒子监测的单次取样量，有以下示例讲解：

粒子单次取样量计算公式说明：

式中VS代表取样点单次取样最低量，用L表示；

Cn,m代表相关等级规定的最大被考虑粒径的等级限值；

20代表当粒子浓度处于该等级限值时，可被检测到的粒子数。

示例：

采用中国GMP (2010年修订) 洁净区B级粒子静态监测标准，该级别静态下考虑到的粒径为5.0μm，标准为29/立方米，计算VS为(20/29)x1000≈689.7L。故洁净区B级静态下粒子单次取样量应不低于689.7L。但日常监测时考虑到采样设备的流量速率和内控标准的严格，会直接测试到700L或1000L。

因此，建议日常粒子监测单次取样量：

A级，动静态均为1000L；

B级静态1000L、动态100L；

C、D级动态静态均为100L。

对于粒子监测的采样次数，房间总采样次数应不低于5次，单点采样次数可以多于1次。企业应根据风险评估或常规数据分析后确定微生物静态监测标准，初期考虑设定和动态标准一致，或设定为动态标准的一半。

培养结束后肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5～10倍放大镜检查，有否遗漏。沉降菌：如果监测时间少于4小时，则以4小时沉降标准判定，无需另外折算。浮游菌采样器放置一般在离地0.8m～1.5m的工作高度取样，或直接放置在操作台面，并离开送风面至少30cm。表面微生物：接触时间为5~10秒，不能转动或移动，取样后在平皿上做好相应标识，采用三步法（第一步：干擦拭去除可见琼脂；第二步：喷消毒剂湿擦；第三步：干擦去除残留消毒剂），以除去残留琼脂。

四、洁净区环境风险评估方法与原则

（一）取样点的设置原则：

（二）评估方式：

在风险评估过程中，充分考虑洁净级别、产品与物料是否直接接触，人员活动频率、直接接触药品的设备表面等因素。根据影响环境检测因素来确定风险等级，并进行风险的控制。

（三）风险分析过程：

1. 风险分析的工具选用FMEA（失效模式和效果分析）。

2. 首先对洁净区内的每一个功能间的每一项活动进行逐步分析，评估出每一项活动的发生频率，发散微生物和粒子的难易程度并等级评分。（国外已经利用瞬时微生物监测设备IMD-A，可对洁净区内的微粒数量和细菌数量进行实时监测，将粒子数量和微生物数量的检测结果在1秒内检测完成，同时可对人员操作所产生的粒子数进行实时测定与分析。）

3. 对其活动的发生频率进行评定评分。

4. 风险评估：根据公式，风险等级RPN=散发微生物和微粒的难易程度*发生率计算出各项活动的风险等级。

（四）风险控制：

根据风险评估的结果、洁净等级、洁净区面积、换气次数、产品暴露时间、人员操作活动范围，确定取样点的位置并进行监控。

（五）洁净区内可能高风险点汇总如下：

五、风险评估解析

1、确定监测频率

合理的环境监测项目应当平衡高效利用资源和监测频率这二者的关系，只有这样才有意义。在欧洲，关于监测频率方面的指导资源非常有限，USP规定的监测频率不一定适用于所有的设备。可以从ISO标准获取一定的指导:主要是ISO14644 and ISO 14698.然而，这些标准不一定符合法律指导性文件，因为它们适用于多个行业的受控环境，不仅仅是标准更高的药品行业。

在确定环境控制程序时，不同控制区域的监测频率可以基于每个功能区的“关键因子”来确定。

2、关键因子

监测频率所基于的临界机制目的在于监控关键工序步骤。因此，同相对封闭的初阶段生产工序而最终制剂工序所接受的监控更多。

使用关键因子是一种基于各个关键区域风险分析以确定监测频率的方法。风险评估涉及到任何风险对产品的潜在影响。如，室温下开放式操作区域，长期暴露时间，存在水，这些将构成高风险并影响更高的风险级别。相反地，密闭工艺的区域，温度较低的区域形成更低的风险及相关风险级别。

从1到6，”1″为最关键的，而“6”为最不关键的，无菌灌装操作为1分;最终制剂工序为2分，开放式操作工艺为3分等等。每位使用者都必须在特定区域使用该打分表并使用支持性理由来定义。基于评分表的监测频率的举例见图表1，其应用举例见图表2.

图表1  监测频率关键因子 关键因子 监测频率 1 每日或每批 2 每周 3 每两周 4 每月 5 每三个月或每个季度 6 每六个月

每个控制区域都将针对设定参数进行评估并使用使用一系列指导性问题来确定监测频率。确定标准要考虑两个主要区域:更多监测点的区域和更高监测频率的区域。这些要素的例子如下:

给予更多监测点的区域包括

“较脏”活动在洁净活动邻近的室内进行，即使是后期工序是洁净活动。

人员流动较多的区域(假设人是最主要的微生物污染源)。可能包括走廊和更衣室。

转移通道。

接受物料进入的区域。

物料准备活动和放置活动持续时间(如:一个30分钟的工序相比一个6少时的操作，关键因子更低)。

需要更高的监测频率

相比寒冷区域的温暖或室温区域。

相比干燥、室温区域的有水或水池的区域。

相比短时间敞开或封闭工序(取决于产品风险暴露时间)的开放性操作工序或开放式工厂生产线。

最终制剂步骤，纯化，分装，产品灌装等。

一旦确定了每个控制区的监测频率，就应当定期回顾。回顾可能发现房间状态的变化从而需要改变监测频率或改成这个房间内使用不同的取样方式。比如回顾一年暑假后，部分房间的表面取样结果高于空气取样结果，在这种情况下，微生物学家可能选择改变监测频率并更多地做表面取样。基干这些数据，将更多地关注清洁消毒行为和频率。

图表2 关键因子的应用 环境关键因子 环境对最终产品的影响可能性 定义 监测频率 1 非常可能 无后续处理的无菌灌装。污染风险会带来可预见的产品影响，因为污染物无法通过后续处理减少或去除 每日或每批 2 可能 最终配制区。适用于最终工序为灭菌级过滤器的区域 每周 3 有一定可能 产品直接或间接地暴露在环境中可能引起污染。也适用于室温区域和高水分含量区域。 每两周 4 不可能 适用于少或无开放式操作的低温区 每月 5 很不可能 不直接暴露于环境中很不可能带来可能影响产品污染。如果引入污染物有充分的后续控制和/或使用防腐剂可以很大程度上去除或明显降低污染。 每三个月或每个季度 6 非常不可能 非受控区域或很少微生物污染可能的区域，如冻干机房。 每六个月或半年

北京中邦兴业作为一家专注于为生物制药、集成电路、芯片、半导体、新能源等行业提供洁净环境整体解决方案。凭借丰富的行业经验和专业技术，公司与国内外数百家知名企业建立了稳定的合作关系，成功交付了上千个配套项目。如果您有洁净室环境监测解决方案方面的需求，问题，都可以帮您直接解答。